In-vitro. Jakie znaczenie w badaniach biomedycznych mają hodowle komórek in-vitro? Sprawdź!

Prowadzenie badań z wykorzystaniem linii komórkowych daje możliwość określenia w warunkach laboratoryjnych bezpieczeństwa stosowania danej substancji oraz jej wpływ na metabolizm komórek ludzkiego organizmu. Hodowle in vitro stały się także alternatywą dla badań na zwierzętach, co stanowi o ich przewadze w aspekcie etycznym. Czym jest hodowla kultur komórkowych in vitro? Czy każdy może pracować z liniami komórkowymi? Czy mają one wpływ na rozwój nauki i badań biomedycznych?

Hodowle komórkowe oparte są na zastosowaniu kultur komórkowych, które stanowią zbiór dzielących się komórek, pozyskanych z jednej lub kilku dzielących się komórek organizmu wielokomórkowego.

W laboratoriach najczęściej wykorzystywane są linie komórkowe wyprowadzone z ludzkich lub zwierzęcych tkanek, które służą do badań w warunkach in vitro, co w skrócie można określić jako “w probówce”. Umożliwia to prowadzenie testów laboratoryjnych na materiale ludzkim, ale w sposób pozaustrojowy i bez konieczności ingerencji w organizm pacjenta. Dzięki temu naukowcy mają narzędzia, aby sprawdzić na przykład wpływ nowego leku na hepatocyty (komórki wątroby) poprzez zastosowanie odpowiedniej linii komórkowej hodowanej w specjalnych naczyniach i pożywkach.

W wielu przypadkach komórki wchodzące w skład danej linii mają cechy komórek nowotworowych, co umożliwia ich odpowiednie namnażanie i przeżywalność w warunkach laboratoryjnych, przy jednoczesnym podobieństwie do komórek nie objętych procesem kancerogenezy.

Hodowla komórkowa wyprowadzona bezpośrednio z materiału dawcy zwana jest hodowlą pierwotną, która po namnożeniu i pierwszym udanym pasażu (przesianiu komórek do nowego naczynia hodowlanego), staje się hodowlą wtórną. W wielu przypadkach takie hodowle in vitro charakteryzują się nieograniczonym czasem życia, co pozwala je sklasyfikować jako linie ciągłe.

Ze względu na typ wzrostu komórki mogą być hodowane w postaci:

• zawiesiny pojedynczych komórek w pożywce,
• monowarstwy porastającej naczynie hodowlane,
• sferycznych tworów, czyli tzw. sferoidów.

Praca z hodowlami komórkowymi wymaga odpowiedniego przeszkolenia oraz sterylnych warunków. Wszystkie czynności związane z wykonywaniem badań muszą być przeprowadzone w komorach laminarnych oraz inkubatorach z optymalnymi warunkami temperaturowymi i wilgotności powietrza dla danego układu doświadczalnego.

Odczynniki i materiały wykorzystywane do badań in vitro (np. pipety, probówki, butelki i szalki hodowlane) muszą być aseptyczne i odpowiednio certyfikowane. W laboratoriach hodowli komórkowych obowiązują też restrykcyjne zasady dotyczące między innymi noszenia odzieży ochronnej, maseczek, czy jednorazowych rękawic. 

Historia linii komórkowych sięga co najmniej lat 50. ubiegłego wieku, kiedy to wyizolowano komórki z raka szyjki macicy 31-letniej Henrietty Lacks. Pobrane komórki pozwoliły na wyprowadzenie pierwszej linii komórkowej, którą nazwano HeLa, na cześć amerykańskiej pacjentki, która była ich dawczynią. Było to wydarzenie przełomowe, wyznaczające nowy kierunek badań między innymi w zakresie onkologii, toksykologii, neurobiologii, farmakologii, biologii molekularnej, a nawet inżynierii tkankowej.

Obecnie stosowanie linii komórkowych ma ogromny wkład w proces poznawania metabolizmu komórek, ich żywotności oraz efektu biologicznego wywieranego przez enzymy, hormony, leki i inne substancje aktywne.

Wykorzystanie hodowli komórkowych in vitro obejmuje zatem wiele wyspecjalizowanych obszarów między innymi z zakresu:

• biotechnologii,
• biologii medycznej,
• biofarmacji,
• toksykologii.

Hodowle in vitro umożliwiają w wielu przypadkach zaprojektowanie eksperymentów, które prowadzone są w warunkach zbliżonych do układu in vivo. W ten sposób przeprowadzane są badania w kierunku transportu leków przez barierę jelitową, nabłonek oddechowy czy barierę krew-mózg. Takie działanie umożliwia oszacowanie toksyczności i przyswajalności nowych substancji leczniczych, jeszcze zanim wejdą one w testy kliniczne. Dzięki takiemu postępowaniu naukowcy mają możliwość określenia jaki jest poziom bezpiecznego stężenia danego leku oraz jaka jest jego biodostępność, mechanizm wchłaniania oraz interakcje z innymi lekami lub składnikami żywności.

Hodowle komórkowe in vitro stanowią cenne narzędzie do produkcji szczepionek, gdyż przy ich użyciu możliwe jest produkowanie syntetycznych białek. Możliwości wykorzystania hodowli in vitro obejmują także badania ekspresji genów pod wpływem substancji badanych oraz określenie ilości cytokin i czynników wzrostu uwalnianych z komórek. 

Ustandaryzowane linie komórkowe in vitro mają charakter komercyjnego produktu, który może być zakupiony przez jednostki naukowe w specjalnych bankach komórek, do których należy:

• Europejska Kolekcja Hodowli Komórkowych (ECACC, ang. The European Collection of Cell Cultures),
• Amerykańska Kolekcja Hodowli Komórkowych (ATCC, ang. American Type Culture Collection).

W bankach tych zdeponowane są linie komórkowe pochodzące od ponad 45 gatunków, które mogą mieć charakter linii komórek prawidłowych i nowotworowych.

Przykładami linii komórkowych, wykorzystywanych w badaniach biomedycznych są między innymi:

• HeLa - linia komórkowa wyizolowana z raka szyjki macicy,
• Caco-2 - linia komórkowa stanowiąca model nabłonka jelitowego i wykorzystywana w badaniach nad transportem substancji przez barierę jelitową,
• HT-29 - linia komórkowa wykorzystywana do badania adhezji bakterii jelitowych,
• Hep G2 - linia komórkowa stanowiąca model hepatocytów,
• Calu 3 – linia komórkowa wykorzystywana w badaniu wchłaniania przez nabłonek oddechowy,
• HaCaT – linia komórkowa keratynocytów człowieka,
• BxPC-3 - linia komórkowa wyprowadzona z raka trzustki człowieka, która jest wykorzystywana w badaniu gruczolakoraków trzustki,
• L929 - linia komórkowa mysich fibroblastów tkanki łącznej,
• 3T3-L1 - linia komórkowa mysich adipocytów.

Dobór odpowiedniej linii komórkowej powinien być szczegółowo przemyślany na etapie projektowania eksperymentu. Pamiętajmy, że badania prowadzone w warunkach in vitro wymagają specjalnego sprzętu i sterylnego plastiku laboratoryjnego, który oferowany jest przez liczne firmy biotechnologiczne.

Zastosowanie linii komórkowych stało się alternatywą dla badań na zwierzętach. Najważniejszy jest tu aspekt etyczny, ale warto podkreślić też możliwość uzyskiwania powtarzalnych wyników, większą stabilność modeli doświadczalnych oraz zminimalizowanie kosztów w przypadku prowadzenia hodowli in vitro. Stały się one cennym narzędziem do prowadzenia szybkich i skutecznych badań przesiewowych nowych substancji nie tylko leczniczych, ale też pielęgnacyjnych, odżywczych oraz uznawanych za dodatki do żywności. 

Pojawienie się pierwszej linii komórkowej z pewnością zrewolucjonizowało możliwości prowadzenia badań laboratoryjnych. Odpowiednie zaprojektowanie eksperymentu z wykorzystaniem hodowli in vitro daje możliwość wykonania badań przedklinicznych i określenia wpływu badanych substancji na organizm człowieka. Mimo niezaprzeczalnych zalet stosowania linii komórkowych w badaniach laboratoryjnych, mają one także swoje ograniczenia. Często uważane są za zbyt uproszczone modele, które nie odzwierciedlają zależności poszczególnych struktur panujących w warunkach in vivo.  Ponadto problemem może być też zastosowanie odpowiednich stężeń badanych substancji oraz wybór właściwej fazy wzrostu komórek. Niezależnie od tych wad, wykorzystanie linii komórkowych stanowi ważne narzędzie pracy wielu ośrodków badawczych, a wyniki uzyskiwane w warunkach in vitro umożliwiają przesiewowe, bezinwazyjne analizy bezpieczeństwa stosowania nowych leków i innych substancji na organizm człowieka.

• Olszewska-Słonina, D. M., Drewa, T. A., Styczyński, J., & Czajkowski, R. (2006). Hodowla komórek, inżynieria tkankowa i medycyna regeneracyjna. Część I. Wiad. Lek, 59, 585-589.
• Stasiak, P., & Sznitowska, M. (2010). Zastosowanie hodowli komórkowych w badaniach biofarmaceutycznych. Farm Pol, 66(3), 228-234.
• Praktikum z hodowli komórek i tkanek. Opracowanie zbiorowe pod redakcją Romana Paducha. Wydawnictwo UMCS, Lublin 2019.
• https://www.atcc.org/ ( Data dostępu: 30.05.2022)